ћ≥кроклональне розмноженн¤
ћ≥кроклональне розмноженн¤ - це масове безстатеве розмноженн¤ в культур≥ in vitro, при ¤кому отриман≥ рослини ≥дентичн≥ до вих≥дноњ батьк≥вськоњ форми.
¬≥д традиц≥йних метод≥в розмноженн¤ рослин воно в≥др≥зн¤Їтьс¤ такими особливост¤ми:
1) отриманн¤м великоњ к≥лькост≥ коп≥й з м≥н≥мальноњ к≥лькост≥ вих≥дного матер≥алу;
2) отриманн¤м, залежно в≥д мети досл≥дженн¤, ¤к генетично однор≥дного матер≥алу, так ≥ сомаклональних вар≥ант≥в;
3) можлив≥сть в≥дбирати in vitro рослинний матер≥ал з ознаками, що ц≥кавл¤ть досл≥дника;
4) можлив≥сть отриманн¤ безв≥русного посадкового матер≥алу при використанн≥ ¤к експланта ап≥кальних меристем та проведенн¤ при необх≥дност≥ термотерап≥њ in vitro;
5) можлив≥сть проводити розмноженн¤ рослин прот¤гом року, оск≥льки њх р≥ст та розвиток in vitro практично не залежать в≥д сезонних зм≥н.
¬перше м≥кроклональне розмноженн¤ було зд≥йснено вченим ћорелем (1960) при досл≥дженн≥ орх≥дей —утbidium. ћодиф≥кађц≥¤ ц≥Їњ методики в даний час широко використовуЇтьс¤ дл¤ масового розмноженн¤ орх≥дних з комерц≥йною метою, а також у виробництв≥ таких культур, ¤к картопл¤, гвоздика, суниц≥.
ћурас≥ге розд≥лив весь процес м≥кроклонального розмноженн¤ на три стад≥њ:
1) ≥н≥ц≥ац≥¤ асептичноњ культури;
2) ≥ндукц≥¤ численних пагон≥в при повторних пасажах на середовище дл¤ розмноженн¤;
3) п≥дготовка сформованих in vitro рослин до висадки в грунт.
” ц≥лому, метод м≥кроклонального розмноженн¤ ірунтуЇтьс¤ на ≥ндукованому циток≥н≥нами розростанн≥ верх≥вкових ≥ пазушних меристем, кожна з ¤ких даЇ початок багатьом пагонам. ѕ≥сл¤ формуванн¤ багатьох пагон≥в, њх розд≥л¤ють на менш≥ групи пагон≥в, перенос¤ть на св≥же середовище, ≥ процес повторюЇтьс¤.
Ўвидк≥сть м≥кроклонального розмноженн¤ вар≥юЇ залежно в≥д виду рослини, але часто можна отримати з Їдиноњ бруньки дек≥лька м≥льйон≥в рослин за р≥к. ќсновними факторами, що впливають на процес м≥кроклонального розмноженн¤, Ї тип експланту, склад поживних середовищ ≥ умови культивуванн¤.
¬их≥дним матер≥алом можуть служити верх≥вков≥ та пазушн≥ меристеми стебла, молод≥ листки, елементи суцв≥тт¤ та кв≥тки, цибулини та бульбоцибулини. ≤деальним матер≥алом дл¤ отриманн¤ численних пагон≥в Ї ап≥кальн≥ та пазушн≥ бруньки здорових рослин, що активно ростуть.
” б≥льшост≥ випадк≥в дл¤ м≥кроклонального розмноженн¤ використовують р≥зноман≥тн≥ модиф≥кац≥њ середовища ћурас≥ге, —куга, хоча де¤к≥ групи рослин можуть мати ≥ндив≥дуальн≥ потреби в поживних речовинах. ультури можуть рости на агаризованих або на р≥дких поживних середовищах на мостиках ≥з ф≥льтрувального паперу.
«алежно в≥д комб≥нац≥й умов культивуванн¤ вих≥дноњ тканини (складу поживних середовищ, температури, св≥тла), можна викликати розвиток пазушних бруньок, ≥ндукувати по¤ву адвентивних бруньок або пагон≥в безпосередньо з кл≥тин експланта або калусу.
ƒл¤ ≥ндукц≥њ численних пагон≥в in vitro ¤к експлант використовують верх≥вков≥ та пазушн≥ бруньки. ¬ той же час, широкого використанн¤ набула культура меристем. ƒодс ≥ –обертс (1985) п≥дкреслюють р≥зноман≥тн≥сть пон¤ть Ђап≥кальна меристемаї та Ђстебловий апексї, визначаючи ап≥кальну меристему ¤к д≥л¤нку стеблового апексу, що розташована дистально в≥дносно наймолодшого листкового приморд≥¤ ≥ маЇ довжину в середньому 80 мм. Ќезважаючи на де¤к≥ труднощ≥ в робот≥ (необх≥дн≥сть ман≥пулюванн¤ м≥н≥атюрними експлантами, низький в≥дсоток виживанн¤ in vitro), культури ап≥кальних меристем широко використовуютьс¤ дл¤ створенн¤ рослинного матер≥алу, що в≥льний в≥д патоген≥в.
ћ≥кроклональне розмноженн¤ провод¤ть шл¤хом вичлененн¤ ап≥кальноњ меристеми. ” даному метод≥ за основу покладена здатн≥сть рослинних фрагмент≥в, що мають точку росту, до в≥дтворенн¤ материнського орган≥зму. ¬ 1949 р. встановлено, що ап≥кальна частина точки росту (0,1 мм), що складаЇтьс¤ з ще недиференц≥йованих кл≥тин (меристема), здатна нести генетичну ≥нформац≥ю орган≥зму, але не м≥стить в≥русних часток, ¤к≥ присутн≥ в диференц≥йован≥й кл≥тин≥ дорослого орган≥зму. ѕом≥щена на поживне середовище, меристема виростаЇ з утворенн¤м нового орган≥зму рослини, ¤кий не м≥стить в≥рус≥в. “аку рослину легко швидко розмножити, розд≥ливши на пагони (4-6), ¤к≥ м≥ст¤ть точки росту. лонуванн¤м наступних покол≥нь меристемних рослин одержують клон материнського орган≥зму з т≥Їю ж генетичною ≥нформац≥Їю, але без в≥русних часток.
” багатьох випадках ефективним способом розмноженн¤ in vitro може служити соматичний ембр≥огенез, тобто, процес формуванн¤ зародковопод≥бних структур (ембр≥оњд≥в), що розвиваютьс¤ ≥з соматичноњ кл≥тини, ≥ можуть дати початок ц≥л≥й рослин≥. —оматичний ембр≥огенез ≥ндукують двома р≥зними шл¤хами: пр¤мим та непр¤мим. ” ход≥ пр¤мого ембр≥огенезу соматичн≥ зародки формуютьс¤ безпосередньо в тканин≥ екаспланту без прол≥ферац≥њ калусу. —формован≥ таким чином рослини ≥дентичн≥ до батьк≥вськоњ форми. Ќепр¤мий шл¤х соматичного ембр≥огенезу пов'¤заний ≥з формуванн¤м ембр≥оњд≥в з дедиференц≥йованих калусних кл≥тин ≥ включаЇ так≥ етапи:
1) ≥ндукц≥¤ проембр≥огенноњ калусноњ маси;
2) розвиток ембр≥оњд≥в з проембр≥огенних кл≥тин;
3) проростанн¤ ембр≥оњд≥в ≥ формуванн¤ рослин.
—еред рослин, що регенерували шл¤хом непр¤мого ембр≥огенезу, нер≥дко зустр≥чаютьс¤ форми, що в≥др≥зн¤ютьс¤ в≥д вих≥дних. —омаклональн≥ вар≥анти, що виникли таким, чином можуть бути використан≥ у подальш≥й селекц≥йн≥й робот≥.
¬егетативне розмноженн¤ in vitro
«елен≥ пагони асептичних рослин розр≥зають на живц≥ довжиною 3-5 мм з одн≥Їю пазушною брунькою ≥ пом≥щають в проб≥рки або колби ≥з середовищем ћS. ƒл¤ пригн≥ченн¤ бактер≥ального зараженн¤ в культур≥ in vitro на першому етап≥ культивуванн¤ можна вводити у склад поживних середовищ антиб≥отик, наприклад, клафоран. –озчин антиб≥отику попередньо стерил≥зують через мембранний ф≥льтр ≥ добавл¤ють в поживне середовище, охолоджене до +40∞—.
ультивуванн¤ провод¤ть на св≥тл≥ при температур≥ +25-+28∞—. ∆ивц≥ вкор≥нюютьс¤ ≥ дають пагони прот¤гом 3-4 тижн≥в п≥сл¤ введенн¤ в культуру. ќтриман≥ пагони можна розмножуђвати шл¤хом живцюванн¤ ≥ вирощувати на безгормональних середовищах або середовищах, що м≥ст¤ть низьк≥ концентрац≥њ ауксин≥в (0,1-0,2 мг/л ё ).
ћетодика м≥кроклонального розмноженн¤
Ўвидке м≥кроклональне розмноженн¤ включаЇ дек≥лька етап≥в.
1. ≤ндукц≥¤ адвентивних бруньок.
¬ерх≥вков≥ та пазушн≥ бруньки простерил≥зованих пагон≥в пом≥щають в колби ≈рленмейЇра в 5 мл р≥дкого поживного середовища ћS, ”айта або √амборга з Ѕјѕ в концентрац≥њ 4-6 мг/л ≥ культивують на св≥тл≥ при 25-28∞— прот¤гом 2-3 тижн≥в. ÷ього часу достатньо дл¤ зн¤тт¤ ап≥кального дом≥нуванн¤. ѕочинаЇтьс¤ ≥нтенсивна прол≥ферац≥¤ адвентивних бруньок.
2. ‘ормуванн¤ пагон≥в.
ѕ≥сл¤ 2-3 тижн≥в культивуванн¤ експланти перенос¤ть на р≥дке поживне середовище того ж складу, але ≥з зниженим вм≥стом Ѕјѕ (до 2 мг/л). Ќа цьому середовищ≥ через 1,5-2 тижн≥ починаЇтьс¤ ≥нтенсивне утворенн¤ пагон≥в. ѕасажуванн¤ (перенесенн¤) на св≥же середовище провод¤ть через кожн≥ два тижн≥.
3. ¬кор≥ненн¤ пагон≥в та формуванн¤ рослин.
—формован≥ пагони вичлен¤ють ≥з прол≥феруючих експлант≥в та пересаджують в окрем≥ проб≥рки на тверде середовище ћS з низькими концентрац≥¤ми IO (0,1-0,2 мг/л) дл¤ вкор≥ненн¤. ѕовн≥стю сформован≥ рослини висаджують у грунт.
–озмноженн¤ рослин шл¤хом вичлененн¤ ап≥кальноњ меристеми
1. √отують поживне середовище ћурас≥ге, —куга.
2. ¬ичлененн¤ меристеми провод¤ть у бокс≥ з лам≥нарним потоком пов≥тр¤. ≥нець стебла (4-5 мм) в≥др≥зають ≥ пом≥щають у поле зору м≥кроскопа. ѕ≥д м≥кроскоп≥чним контролем п≥нцетом ≥з спец≥альним пристроЇм в≥др≥зають 0,2-0,5 мм ап≥кальноњ частини стебла ≥ в≥докремлюють к≥нцеву некл≥тинну недиференц≥йовану масу - близько 0,1 мм в≥д верхнього к≥нц¤.
3. ¬исадка ≥ вирощуванн¤.
” стерильних умовах проб≥рки ≥з стерильним поживним середовищем в≥дкривають, нахил¤ють п≥д кутом 45∞ ≥ користуючись стерильним п≥нцетом, меристему занурюють у поживне середовище. ѕроб≥рки закривають ватними пробками ≥ перенос¤ть в термальну к≥мнату ≥з температурою пов≥тр¤ +25-+35∞C та ц≥лодобовим осв≥тленн¤м люм≥несцентними лампами. „ерез 2-3 тижн≥ ≥з меристеми виростаЇ рослина.
4. ¬ирощен≥ ≥з меристеми рослини в стерильних умовах виймають ≥з проб≥рок ≥ живцюють таким чином, щоб кожний ≥з живц≥в мав точку росту.
ќдержан≥ живц≥ висаджують у поживне середовище. „ерез 1-2 тижн≥ ≥з них виростають рослини.
|
|
|
|
